nieuws

Polymerasekettingreactie (PCR)

AP.BIO:

IST-1 (EU)

,

IST-1.P (LO)

,

IST-1.P.1 (EK)

Een techniek die wordt gebruikt om een ​​specifiek doelgebied van DNA te amplificeren of er veel kopieën van te maken.

 

Belangrijkste punten:

  • Polymerasekettingreactie, of PCR, is een techniek om veel kopieën te maken van een specifiek DNA-gebied in vitro (in een reageerbuis in plaats van een organisme).
  • PCR is gebaseerd op een thermostabiel DNA-polymerase, Taq polymerase, en vereist DNA primers speciaal ontworpen voor het DNA-gebied van belang.
  • Bij PCR wordt de reactie herhaaldelijk gecycleerd door een reeks temperatuurveranderingen, waardoor veel kopieën van het doelgebied kunnen worden geproduceerd.
  • PCR heeft veel onderzoeks- en praktische toepassingen. Het wordt routinematig gebruikt bij het klonen van DNA, medische diagnostiek en forensische analyse van DNA.

Wat is PCR?

Polymerasekettingreactie (PCR) is een veelgebruikte laboratoriumtechniek die wordt gebruikt om vele kopieën (miljoenen of miljarden!) van een bepaald DNA-gebied te maken. Dit DNA-gebied kan alles zijn waarin de onderzoeker geïnteresseerd is. Het kan bijvoorbeeld een gen zijn waarvan een onderzoeker de functie wil begrijpen, of een genetische marker die door forensische wetenschappers wordt gebruikt om het DNA van de plaats delict te matchen met verdachten.

Typisch is het doel van PCR om genoeg van het doel-DNA-gebied te maken dat het kan worden geanalyseerd of op een andere manier kan worden gebruikt. DNA geamplificeerd door PCR kan bijvoorbeeld worden verzonden voor volgorde aanbrengen in, gevisualiseerd door gelelektroforese, of gekloond in een plasmide voor verdere experimenten.

PCR wordt gebruikt in veel gebieden van biologie en geneeskunde, waaronder moleculair biologisch onderzoek, medische diagnostiek en zelfs sommige takken van ecologie.

Taq-polymerase

Leuk vinden DNA-replicatie in een organisme vereist PCR een DNA-polymerase-enzym dat nieuwe DNA-strengen maakt, waarbij bestaande strengen als sjablonen worden gebruikt. Het DNA-polymerase dat typisch wordt gebruikt in PCR wordt genoemd Taq polymerase, na de hitte-tolerante bacterie waaruit het werd geïsoleerd (Thermus aquaticus).

T. aquaticus leeft in warmwaterbronnen en hydrothermale bronnen. Zijn DNA-polymerase is zeer hittestabiel en het meest actief rond 70 °\tekst C70 °C70, °, starttekst, C, eindtekst (een temperatuur waarbij een mens of E coli DNA-polymerase zou niet-functioneel zijn). Deze hittestabiliteit maakt Taq-polymerase ideaal voor PCR. Zoals we zullen zien, wordt hoge temperatuur herhaaldelijk gebruikt in PCR om denatureren het matrijs-DNA, of de strengen ervan scheiden.

PCR-primers

Net als andere DNA-polymerasen, Taq polymerase kan alleen DNA maken als het een inleiding, een korte reeks nucleotiden die een startpunt vormt voor DNA-synthese. In een PCR-reactie bepaalt de onderzoeker het DNA-gebied dat wordt gekopieerd of geamplificeerd door de primers die hij of zij kiest.

PCR-primers zijn korte stukjes enkelstrengs DNA, meestal rond 202020 nucleotiden lang. Bij elke PCR-reactie worden twee primers gebruikt en ze zijn zo ontworpen dat ze het doelgebied flankeren (gebied dat gekopieerd moet worden). Dat wil zeggen, ze krijgen sequenties die ervoor zorgen dat ze binden aan tegenovergestelde strengen van het matrijs-DNA, net aan de randen van het gebied dat moet worden gekopieerd. De primers binden aan de matrijs door complementaire basenparing.

Sjabloon-DNA:

5′ TATCAGATCCATGGAGT…GAGTACTAGTCCTATGAGT 3′ 3′ ATAGTCTAGGTACCTCA…CTCATGATCAGGATACTCA 5′

Primer 1: 5′ CAGATCCATGG 3′ Primer 2:

Wanneer de primers aan de matrijs zijn gebonden, kunnen ze worden verlengd door de polymerase en wordt het gebied dat ertussen ligt gekopieerd.

[Meer gedetailleerd diagram dat de richting van DNA en primer toont]

De stappen van PCR

De belangrijkste ingrediënten van een PCR-reactie zijn: Taq polymerase, primers, template-DNA en nucleotiden (DNA-bouwstenen). De ingrediënten worden in een buis geassembleerd, samen met de cofactoren die het enzym nodig heeft, en ondergaan herhaalde cycli van verwarming en koeling waardoor DNA kan worden gesynthetiseerd.

De basisstappen zijn:

  1. Denaturatie (96 °\tekst C96°C96, °, starttekst, C, eindtekst): Verwarm de reactie sterk om de DNA-strengen te scheiden of te denatureren. Dit biedt een enkelstrengs sjabloon voor de volgende stap.
  2. gloeien (555555 - 656565°\text C°C°, starttekst, C, eindtekst): Koel de reactie zodat de primers kunnen binden aan hun complementaire sequenties op het enkelstrengs template-DNA.
  3. Verlenging (72 °\tekst C72°C72, °, starttekst, C, eindtekst): Verhoog de reactietemperaturen zodat Taq polymerase verlengt de primers, waardoor nieuwe DNA-strengen worden gesynthetiseerd.

Deze cyclus herhaalt zich 252525 - 353535 keer in een typische PCR-reactie, die in het algemeen 222 - 444 uur duurt, afhankelijk van de lengte van het DNA-gebied dat wordt gekopieerd. Als de reactie efficiënt is (goed werkt), kan het doelgebied gaan van slechts één of enkele kopieën tot miljarden.

Dat komt omdat niet alleen het originele DNA elke keer als sjabloon wordt gebruikt. In plaats daarvan kan het nieuwe DNA dat in de ene ronde wordt gemaakt, dienen als een sjabloon in de volgende ronde van DNA-synthese. Er zijn veel kopieën van de primers en veel moleculen van Taq polymerase drijft rond in de reactie, dus het aantal DNA-moleculen kan ongeveer verdubbelen in elke ronde van fietsen. Dit patroon van exponentiële groei wordt weergegeven in de onderstaande afbeelding.

Gelelektroforese gebruiken om de resultaten van PCR . te visualiseren

De resultaten van een PCR-reactie worden meestal gevisualiseerd (zichtbaar gemaakt) met behulp van gelelektroforeseGelelektroforese is een techniek waarbij DNA-fragmenten door een elektrische stroom door een gelmatrix worden getrokken en DNA-fragmenten op grootte worden gescheiden. Een standaard of DNA-ladder wordt typisch meegeleverd zodat de grootte van de fragmenten in het PCR-monster kan worden bepaald.

DNA-fragmenten van dezelfde lengte vormen een "band" op de gel, die met het oog te zien is als de gel wordt gekleurd met een DNA-bindende kleurstof. Een PCR-reactie die een fragment van 400400400 basenparen (bp) produceert, ziet er bijvoorbeeld als volgt uit op een gel:

Linkerbaan: DNA-ladder met banden van 100, 200, 300, 400, 500 bp.

Rechterbaan: resultaat van PCR-reactie, een band bij 400 bp.

Een DNA-band bevat vele, vele kopieën van het doel-DNA-gebied, niet slechts één of enkele kopieën. Omdat DNA microscopisch klein is, moeten er veel kopieën van aanwezig zijn voordat we het met het oog kunnen zien. Dit is een groot deel van de reden waarom PCR een belangrijk hulpmiddel is: het produceert genoeg kopieën van een DNA-sequentie die we dat DNA-gebied kunnen zien of manipuleren.

Toepassingen van PCR

Met behulp van PCR kan een DNA-sequentie miljoenen of miljarden keren worden geamplificeerd, waardoor voldoende DNA-kopieën worden geproduceerd om met andere technieken te worden geanalyseerd. Het DNA kan bijvoorbeeld worden gevisualiseerd door gelelektroforese, verzonden naar volgorde aanbrengen in, of verteerd met restrictie-enzymen en gekloond in een plasmide.

PCR wordt in veel onderzoekslaboratoria gebruikt en heeft ook praktische toepassingen in forensisch onderzoek, genetische tests en diagnostiek. PCR wordt bijvoorbeeld gebruikt om genen geassocieerd met genetische aandoeningen te amplificeren uit het DNA van patiënten (of uit foetaal DNA, in het geval van prenataal onderzoek). PCR kan ook worden gebruikt om te testen op een bacterie of DNA-virus in het lichaam van een patiënt: als de ziekteverwekker aanwezig is, kan het mogelijk zijn om delen van zijn DNA uit een bloed- of weefselmonster te amplificeren.

Voorbeeldprobleem: PCR in forensisch onderzoek

Stel, u werkt in een forensisch laboratorium. U heeft zojuist een DNA-monster ontvangen van een haar achtergelaten op een plaats delict, samen met DNA-monsters van drie mogelijke verdachten. Jouw taak is om een ​​bepaalde genetische marker te onderzoeken en te zien of een van de drie verdachten overeenkomt met het haar-DNA voor deze marker.

De marker is er in twee allelen of versies. De ene bevat een enkele herhaling (bruin gebied hieronder), terwijl de andere twee exemplaren van de herhaling bevat. In een PCR-reactie met primers die het herhalingsgebied flankeren, produceert het eerste allel een 200200200 \text{bp}bpstart-tekst, b, p, eindtekst-DNA-fragment, terwijl het tweede een 300300300 \text{bp}bpstart-tekst produceert, b , p, eind tekst DNA fragment:

Markerallel 1: primers die het herhalingsgebied flankeren, versterken een DNA-fragment van 200 bp

Marker-allel 2: primers die het herhalingsgebied flankeren, versterken een DNA-fragment van 300 bp

Je voert PCR uit op de vier DNA-monsters en visualiseert de resultaten door gelelektroforese, zoals hieronder weergegeven:

De gel heeft vijf banen:

Eerste rijstrook: DNA-ladder met banden van 100, 200, 300, 400 en 500 bp.

Tweede baan: DNA van plaats delict, 200 bp band.

Derde baan: verdacht #1 DNA, band van 300 bp.

Vierde baan: verdacht #2 DNA, banden van 200 en 300 bp.

Vijfde baan: verdacht #3 DNA, 200 bp band.

Het DNA van de verdachte komt overeen met het DNA van de plaats delict op deze marker?

Kies 1 antwoord:

Kies 1 antwoord:

(Keuze A)

A

Verdachte 111

(Keuze B)

B

Verdachte 222

(Keuze C)

C

Verdachte 333

(Keuze D)

D

Geen van de verdachten

[Tip]

We kunnen je antwoord niet beoordelen. Het lijkt erop dat je iets leeg hebt gelaten of een ongeldig antwoord hebt ingevoerd.

Rekening

Meer over PCR en forensisch onderzoek

Bij echte forensische tests van DNA van een plaats delict zouden technici een analyse uitvoeren die conceptueel vergelijkbaar is met die in het bovenstaande voorbeeld. Er zouden echter een aantal verschillende markers (niet alleen de enkele marker in het voorbeeld) worden vergeleken tussen het DNA van de plaats delict en het DNA van de verdachten.

Ook komen de markers die in een typische forensische analyse worden gebruikt niet in slechts twee verschillende vormen voor. In plaats daarvan zijn ze zeer polymorf (poly = veel, morph = vorm). Dat wil zeggen, ze komen in veel allelen voor die in kleine stappen van lengte variëren.

Het meest gebruikte type markers in forensisch onderzoek, genaamd korte tandemherhalingen (STR's), bestaan ​​uit veel herhalende kopieën van dezelfde korte nucleotidesequentie (meestal 222 tot 555 nucleotiden lang). Eén allel van een STR kan 202020-herhalingen hebben, terwijl een ander misschien 181818 heeft, en een ander allel slechts 101010^11start superscript, 1, end superscript.

Door meerdere markers te onderzoeken, die elk in vele allelvormen voorkomen, kunnen forensische wetenschappers een unieke genetische "vingerafdruk" maken van een DNA-monster. In een typische STR-analyse met 131313-markers is de kans op een vals-positief (twee mensen met dezelfde DNA-vingerafdruk) minder dan 111 op 101010 \text{billion}billionstart text, b, i, l, l, i, o, n, einde tekst^11start superscript, 1, einde superscript!

Hoewel we kunnen denken aan DNA-bewijs dat wordt gebruikt om criminelen te veroordelen, heeft het een cruciale rol gespeeld bij het vrijpleiten van vals beschuldigde mensen (waaronder sommigen die jarenlang in de gevangenis zaten). Forensische analyse wordt ook gebruikt om het vaderschap vast te stellen en om menselijke resten van rampscènes te identificeren.

[Naamsvermelding en referenties]

Ben jij een student of een leraar?

StudentLeraar

 


Posttijd: jan-08-2021